細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染是經(jīng)常發(fā)生的。在細(xì)胞培養(yǎng)物中消除、滅活或抑制支原體常用的方法是用抗生素處理。
然而,一般來說,單靠抗生素處理不能長久地消除支原體。此外,抗生素的細(xì)胞毒性可在真核細(xì)胞中引起不良反應(yīng),并可能促進(jìn)耐藥支原體菌株的發(fā)展。因此推薦使用,針對支原體起作用的支原體清除試劑——Mynox® Gold。
產(chǎn)品名稱:珍貴細(xì)胞株 清除支原體試劑
英文:Mynox® Gold Mycoplasma Elimination Reagent
品牌:Minerva-Biolabs®
貨號:10-0201
規(guī)格:2套/盒
產(chǎn)品特點(diǎn)及原理
Mynox® Gold代表了經(jīng)典Mynox®試劑的進(jìn)一步發(fā)展,將抗生素和生物試劑與生物物理作用模式相結(jié)合,從而盡可能殺滅細(xì)胞中的支原體。
與其他細(xì)菌細(xì)胞相比,支原體沒有細(xì)胞壁,但被質(zhì)膜包圍。Mynox® Gold中含有的生物試劑可整合到支原體膜中,并損害其完整性。由于這種聯(lián)合配方,生物試劑和抗生素的有效劑量可以降低到更低的細(xì)胞毒性,同時(shí)仍然可靠和明確地消除支原體。
該試劑的生物物理作用模式將耐藥菌株的發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)降至可忽略不計(jì)的水平。
使用方法
Mynox® Gold的一次應(yīng)用包括4個(gè)小瓶:1個(gè)『治療液』和2個(gè)『鞏固液』,每種成分都是無菌的即用型溶液。『治療液』破壞大部分支原體顆粒,而『鞏固液』不可逆轉(zhuǎn)地破壞所有剩余顆粒,將支原體從處理過的細(xì)胞培養(yǎng)物中消除。兩種處理方法對培養(yǎng)的細(xì)胞都是無害的。
以下方法步驟是為需要標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的典型細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的,可用于貼壁和懸浮細(xì)胞系,個(gè)別情況下可能需要對這些程序進(jìn)行修改和優(yōu)化。
一、『治療液』混合物的制備
1.將4.5 ml含5% v/v FCS的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基移入15ml無菌錐形離心管中,并加入500µl Mynox®Gold Starter Treatment(橙紅色蓋的小瓶)。
2.旋渦Mynox® Gold/培養(yǎng)基混合物。
3.將Mynox® Gold培養(yǎng)基混合物(5ml)轉(zhuǎn)移到無菌25平方厘米細(xì)胞培養(yǎng)瓶或無菌6cm培養(yǎng)皿中。
二、制備細(xì)胞
1.像往常一樣傳代細(xì)胞,用胰蛋白酶分離細(xì)胞團(tuán),獲得單個(gè)細(xì)胞。
2.將含有5% (v/v) FCS的5ml細(xì)胞培養(yǎng)基中的10^4 - 10^5個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Mynox®Gold培養(yǎng)基混合物中。處理混合物的總?cè)莘e為10 ml,最終FCS濃度為5% (v/v)。
3.輕輕地前后左右搖動燒瓶或培養(yǎng)皿,以避免細(xì)胞分布不均勻。像往常一樣孵育細(xì)胞,然后進(jìn)行Mynox® Gold鞏固處理。
三、鞏固處理
1.培養(yǎng)細(xì)胞至80 - 90%的融合度。
2.以常規(guī)方式傳代。向含新鮮培養(yǎng)基的9.5 ml傳代細(xì)胞中,加入500µl Mynox®Gold『鞏固液』試劑(白色透明帽的小瓶)。調(diào)整FCS濃度。不再需要添加5% (v/v)的FCS。
3.重復(fù)Mynox® Gold鞏固處理2次以上。在第3次治療后(從起始處理開始共4代),支原體消除程序完成。
四、支原體檢測
1. Mynox® gold處理的細(xì)胞培養(yǎng)物和病毒庫需要在不含支原體抗生素的情況下再培養(yǎng)4代,然后才能檢測支原體是否再次出現(xiàn)。對于高靈敏度的支原體污染檢測,我們推薦使用基于PCR的Venor®GeM支原體檢測試劑盒
2. 定期重復(fù)PCR支原體檢測試驗(yàn),以確保維持無支原體的細(xì)胞培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)
??由于Mynox®Gold的作用模式是基于其與支原體膜的物理絡(luò)合作用,因此有效的治療需要試劑與支原體顆粒直接接觸。應(yīng)避免治療細(xì)胞團(tuán)。支原體可以積聚在細(xì)胞間隙以及細(xì)胞膜的口袋和縫隙中,從而逃避與藥物的接觸。在對細(xì)胞進(jìn)行消化處理時(shí),需要在顯微鏡下檢查,確保對單個(gè)細(xì)胞的處理。如有必要,增加胰蛋白酶處理的持續(xù)時(shí)間或通過仔細(xì)上下移液機(jī)械分解細(xì)胞團(tuán)。
??用于處理的細(xì)胞總數(shù)不應(yīng)超過10^5個(gè)細(xì)胞(每個(gè)25平方厘米的細(xì)胞培養(yǎng)瓶或6厘米的培養(yǎng)皿)。這保證了低支原體負(fù)荷。
??向『治療液』中添加細(xì)胞時(shí),應(yīng)將移液管直接插入治療混合物中,以避免氣溶膠。注意不要用吸管頭接觸燒瓶內(nèi)壁或培養(yǎng)皿內(nèi)壁。
??支原體去除處理后,不應(yīng)直接使用基于PCR的檢測方法。Mynox® Gold溶解支原體顆粒,隨后將支原體DNA釋放到培養(yǎng)基中。然后可以通過PCR檢測到游離DNA,導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
??Mynox® Gold的效果,受反應(yīng)混合物中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)濃度的影響,例如,培養(yǎng)基補(bǔ)充劑的成分,如胎牛血清(FCS)。這些成分競爭性地結(jié)合Mynox® Gold中所含的生物試劑,并防止其與支原體膜結(jié)合。因此,我們建議,在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用5% v/v FCS進(jìn)行。由于血清蛋白和脂質(zhì)成分的抑制作用,目前還沒有針對高蛋白和脂質(zhì)濃度生物制劑的治療方案。
??細(xì)胞培養(yǎng)基的類型不影響處理的效率。抗生素,特別是在需要選擇的情況下,可以在治療混合物中使用。